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小分子肽是介于氨基酸和蛋白質之間的一種生化物質，是多個氨基酸聚合而成的短鏈，與蛋白質之間一直未有明確界限。多肽的制備方法主要有天然提取，化學合成，基因工程，和生物重組法等，結構相對簡單的多肽較常用化學合成的方法制備獲得，是多肽藥物的主要制備方式。而在多肽藥物的研發中，由于多肽的諸多特點，造成了其在分析過程中的難點和挑戰。針對多肽類藥物生物分析的挑戰與對策展開了討論和分享，本文章對此進行了總結。


與傳統的化學藥物和蛋白質類似藥物相比，多肽藥物具有活性顯著，特異性較強，與受體的親和性好，毒性較弱且不易在體內蓄積；與蛋白類大分子藥物相比，除了多肽疫苗外，多肽類藥物免疫原性相對較小，用藥劑量少，單位活性更高，易于合成、改造和優化，產品純度高，質量可控，能夠迅速確定藥用價值。


近幾年，全球多肽藥物市場整體處于發展上升期，市場規模復合增速達12%以上，市場規模達到280多億美元。因為多肽在機體內扮演的角色多種多樣，參與眾多生理功能，所以多肽藥物的發展前景不可 ** 。


據不完全統計，有約500多個多肽產品在全球進入開發階段，約73種多肽產品，在美國和其它國家獲批，150多種多肽在臨床階段，近一半在臨床二期，每年陸陸續續都有新的多肽藥物獲批，近三年獲美國FDA獲批的多肽藥物參見下表：


獲美國FDA獲批的多肽藥物


在80年代早期所研發的多肽長度大多不超過10個氨基酸，現在近幾十年內有所增加，趨向于40個氨基酸甚至更長。2019年口服索馬魯肽在美國FDA獲批轟動業內，因為長度較大的多肽類藥物，想要實現口服、腸道吸收就必須面臨腸道中多種肽酶降解的挑戰，口服索瑪魯肽的獲批無疑為業界在新劑型的多肽藥物的開發方面起到了里程碑意義的示范作用。未來多肽藥物的研發除了基于劑型的改變和優化，新的多肽藥物遞送方式、半衰期被延長的修飾化或融合多肽藥物將推動此類藥物分子的發展。此外，腫瘤抗原肽的開發也成為當前腫瘤研究領域的一大熱點。


多肽類分子作為藥物亦有其弊端：多肽類藥物半衰期短，會被機體快速消除，為了達到有效濃度可能需要頻繁給藥，成本較高且給患者造成較大的生活負擔；穩定性差，容易被酶解，甚至對酸、堿、高溫或有機溶劑等敏感而容易失活等。


一、多肽類藥物生物分析面臨的難點與挑戰
多肽的生物分析主要包括PK藥代動力學試驗，TK毒代動力學試驗以及抗藥抗體ADA試驗。分析所用到的方法主要包括LC-MS/MS和LBA配體受體結合試驗。在多肽藥物的分析方法建立中，正是由于多肽的種種特征，造成了其生物分析的挑戰和難點，主要表現在以下幾方面：


（1）分子量小、半衰期短


檢測多肽的關鍵試劑是抗體。而多肽的分子量小，結構不是很復雜，使得多肽表位數目有限，往往具有類半抗原的性質，抗體難以產生或效價極低，這都為生物分析關鍵性試劑抗體的制備帶來很大的挑戰。由于多肽的半衰期短，在機體中往往表現為快速消除，因此生物分析方法的靈敏度和檢測下限有了更高的要求。


（2）給藥方式與給藥劑量


在眾多的給藥方式中，靜脈給藥是生物利用度較高的，而許多較長的多肽類藥物在血液中的半衰期一般很短，靜脈注射后很快就被清除或降解。非靜脈給藥的方式生物利用度低給生物分析提出了挑戰。如許多激素類藥物多為皮下給藥，且藥劑量偏低，因此需要檢測方法更加靈敏，更低的檢測下限。


（3）內源性對應物的干擾


在對有內源性對應物的多肽分子建立分析方法時，我們需要特異性非常高的抗體試劑才能夠區分出內源性和外源性的分子，這就給抗體的制備帶來了很大的挑戰。同時，由于多肽的內源性對應物在體內是動態變化的，因此能夠區分并排除內源性分子干擾分析方法是很必要的。


（4）穩定性的影響


多肽類產品的穩定性問題是在生物分析方法開發中常見的問題，尤其是一些缺乏修飾基團或多肽兩端缺乏保護性基團的肽類分子。許多分子在高溫、凍存、震蕩或酸堿條件下，脆弱敏感，甚至降解或構象變化為生物分析方法各種細節性的質量控制等都帶來挑戰。


二、多肽藥物生物分析的應對策略
針對分子量小，難以制備特異性的高效價抗體的挑戰，我們可以采取利用大分子抗原作為載體與多肽進行偶聯的免疫策略，并嘗試不同的免疫佐劑來激發機體的免疫反應，產生抗體。必要時也可考慮多肽抗原的同源串聯重組表達；免疫時盡可能選擇與多肽分子同源性相距遠的動物種屬免疫。


對于多肽分子的內源性對應物的干擾，早做準備，為具有優質選擇性的抗體制備提供充足時間，從而構建一個非常特異的針對外源性藥物分子的方法，必要時盡可能采用對內、外源性分子分別開發方法以計算扣除內源性分子；也可以結合對所分析的藥物和內源性對應物結構和性質上差異點的認識，針對性采取策略消除內源性分子。


針對多肽分子穩定性差、易降解的挑戰，有以下方法進行應對，如采樣時，選擇好抗凝劑或酶抑制劑防范藥物降解，利用玻璃管或添加不同的表面活性劑防止多肽的吸附或聚集等。在分析實踐中用于配制工作液或儲備液的各緩沖液配方很重要，生物技術藥物分析部門有好多基于經驗的試劑配方，可以在實踐中供大家合作試用。


提高方法的靈敏度可以基于不同的技術平臺來開發方法，一般來說，電化學發光法比化學發光，化學發光比熒光，熒光比普通可見光吸收法更容易實現較高的靈敏度。基于不同的信號模式，選用不同的分子標記方式。同樣的試劑材料，基于不同的Assay For ** t改變也可以改善靈敏度。另外基于底物的變化和信號放大系統的應用或組合應用也可以實現靈敏度的提高。

檢測平臺的優勢并非絕對，基于經驗和原理將不同策略組合運用尤為重要。在多肽類生物技術藥物分析上，生物技術藥物分析部科靈活運用ELISA, ECL, TRFIA, CLIA, IF, IP, CoIP, qPCR, FACS, ELISpot, 酶學等多種方法，支持*生物藥如蛋白、抗體（單抗、雙或多特異性抗體、抗體片段）、ADC、多肽、核酸、疫苗及細胞基因治療等藥物在早期開發、臨床前和臨床階段的PK/TK/Immunogenicity(Total ADA& Nab)/Bio ** rker&Cytokine等研究評價。目前已經支持了多個涉及Her2, Trop2, Muc1等靶點的ADC藥物，和EGFR,PCSK9, IL-17A, IL-6, IL-23, VEGF, CD47, TNF-α, CD20，TIGIT等熱門靶點及4-1BB, PD1, PDL-1, CTLA4等免疫檢查點的單抗或多抗藥物，針對CD19類的CAR-T，還有各類融合蛋白、核酸以及眾多涉及糖尿病、心血管、骨、腫瘤等相關疾病的多肽類藥物不同階段的研究工作。

關鍵詞：  多肽類藥物質量分析  重金屬量檢測  實驗動物疾病模型機構  除病毒測試  生物分解能力檢測  功能性評價報告